La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une méthode de laboratoire qui permet aux chercheurs de produire une quantité importante d’ADN spécifique en utilisant des traces d’ADN source, qui peuvent être obtenues à partir d’une variété d’organismes et de tissus (Garibyan & Avashia, 2013). Lorsqu’elle a été découverte dans les années 1980, la technique – qui peut produire des milliards de copies d’ADN spécifique en un après-midi – a eu un impact immédiat sur la biologie moléculaire, les machines effectuant la PCR devenant rapidement un outil couramment utilisé dans les laboratoires (Mullis, 1990).
Pour réaliser la PCR, les chercheurs doivent d’abord créer un mélange contenant les éléments suivants : l’ADN matrice qu’ils souhaitent amplifier ; une ADN polymérase thermostable ; deux amorces oligonucléotidiques appropriées ; chacun des quatre nucléotides ; ainsi qu’un tampon de réaction (Coleman & Tsongalis, 2006). Une ADN polymérase qui est souvent utilisée pour la PCR est la polymérase Taq, qui peut résister à des températures élevées (Chien, et al., 1976). Ces composants sont mélangés et soumis à un cycle de trois étapes programmées modifiant à plusieurs reprises sa température, permettant l’amplification de l’ADN (Weier & Gray, 1988; Kramer & Coen, 2001).
La première étape consiste à chauffer le mélange à haute température (par exemple, 95°C), provoquant la séparation des deux brins d’ADN complémentaires de l’ADN matrice – un processus appelé dénaturation de l’ADN (Mergny & Lacroix, 2003). Ensuite, le mélange est rapidement ramené à une température plus basse, permettant aux deux amorces de se lier au début et à la fin des segments d’ADN cibles que les chercheurs veulent amplifier. Cette étape est connue sous le nom de recuit d’amorce et ne peut avoir lieu que si l’ADN cible et les amorces sont complémentaires en séquence (Garibyan & Avashia, 2013). L’étape finale consiste à chauffer à nouveau le mélange à une température permettant à l’ADN polymérase d’étendre les amorces en ajoutant des nucléotides au brin d’ADN cible, en dupliquant en fait le segment qui se trouve entre les deux amorces; ce dernier processus est appelé extension (Mullis, 1990). La PCR est une méthode d’amplification exponentielle : à chaque répétition de ce cycle en trois étapes, le nombre d’ADN double.
Comme les chercheurs obtiennent généralement la séquence d’ADN de la protéine qu’ils souhaitent étudier dans un vecteur plasmidique qui ne convient pas à leurs besoins, le clonage est une application courante de la PCR. La technique leur permet de cloner facilement et rapidement la séquence d’ADN dans un vecteur plasmidique approprié. Tout d’abord, la PCR est utilisée pour linéariser le plasmide cible, en utilisant des amorces qui s’amplifieront dans des directions opposées au niveau de la section d’insertion cible. La PCR est ensuite appliquée à nouveau pour amplifier l’ADN matrice du plasmide d’origine, en utilisant des amorces qui se lient à moitié à l’ADN cible et à moitié imitent la section du vecteur plasmidique où la séquence doit être insérée. Enfin, une enzyme est utilisée pour créer des sections d’ADN simple brin aux extrémités du gène à insérer et du nouveau vecteur, et une ADN ligase ferme les liaisons phosphodiester, reliant l’ADN cible au nouveau vecteur plasmidique, un processus connue sous le nom de réaction de ligation (Lodish et al., 2000).
La PCR est particulièrement appropriée pour le clonage car il s’agit d’une technique très sensible produisant des résultats rapides, permettant aux chercheurs de produire rapidement des copies d’ADN spécifiques à séquencer et à analyser. Par exemple, la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) permet aux chercheurs de détecter et de quantifier l’ADN produit pendant sa synthèse, ce qui peut être appliqué pour analyser les changements dans les niveaux d’expression génique avec une grande précision dans des facteurs pathologiques particuliers, tels que tumeurs et microbes (Garibyan & Avashia, 2013).
Mais la sensibilité de la PCR en fait également une technique très spécifique, nécessitant que les détails de la séquence soient disponibles pour au moins une partie de l’ADN cible. La sensibilité de la PCR et sa capacité à produire un grand nombre de copies à partir de traces d’ADN est également une source de prudence pour les chercheurs et les praticiens analysant les résultats : un résultat positif ne se traduira pas nécessairement par un diagnostic et pourrait être cliniquement non pertinent (Sellon, 2003). Enfin, l’ADN polymérase utilisée dans la dernière étape de la PCR peut être sujette à des erreurs, entraînant des mutations inattendues dans les fragments générés (McInerney et al., 2014). C’est pourquoi il est recommandé de séquencer l’ADN dans les nouveaux plasmides vecteurs pour confirmer que l’ADN cible a été correctement amplifié et inséré lors de la réaction PCR.
Références:
Chien, A., Edgar, DB et Trela, JM (1976). Acide polymérase désoxyribonucléique de l’extrême thermophile Thermus aquaticus. Journal de bactériologie, 127(3), 1550-1557.
Coleman, WB, Tsongalis, GJ (2006). La réaction en chaîne par polymérase. Diagnostic moléculaire47-55.
Garibyan, L., & Avashia, N. (2013). Des techniques de recherche simplifiées : la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Le Journal de la dermatologie d’investigation, 133(3), e6.
Kramer, MF et Coen, DM (2001). Amplification enzymatique de l’ADN par PCR : procédures standard et optimisation. Protocoles actuels en biologie moléculaire, 56(1), 15-1.
Lodish, H., Berk, A., Zipursky, SL, Matsudaira, P., Baltimore, D. et Darnell, J. (2000). Clonage d’ADN avec des vecteurs plasmidiques. Dans Biologie cellulaire moléculaire. 4e éditionarticle 7.1.
McInerney, P., Adams, P. et Hadi, MZ (2014). Comparaison du taux d’erreur lors de la réaction en chaîne de la polymérase par l’ADN polymérase. Biologie moléculaire internationale, 2014.
Mergny, JL, & Lacroix, L. (2003). Analyse des courbes de fusion thermique. Oligonucléotides, 13(6), 515-537.
Mullis, KB (1990). L’origine inhabituelle de la réaction en chaîne par polymérase. Scientifique Américain, 262(4), 56-65.
En ligneSellon, RK (2003). Mise à jour sur les techniques moléculaires pour les tests de diagnostic des maladies infectieuses. Cliniques vétérinaires : Cabinet pour petits animaux, 33(4), 677-693.
Weier, HU, & Gray, JW (1988). Un système programmable pour effectuer la réaction en chaîne par polymérase. ADN, sept(6), 441-447.
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